Rekombináns fehérje: előállítási és alkalmazási módszerek

A fehérje minden szervezet fontos összetevője. Mindegyik molekula egy vagy több aminosavból álló polipeptidláncból áll. Bár az élethez szükséges információkat DNS vagy RNS kódolja, a rekombináns fehérjék biológiai széles skáláját hajtják végre funkciók az organizmusokban, beleértve az enzimatikus katalízist, védelmet, támogatást, mozgást és szabályozást. A szervezetben betöltött funkcióik szerint ezek az anyagok különböző kategóriákba sorolhatók, mint például antitestek, enzimek, szerkezeti komponensek. Tekintettel a fontos funkciókra, az ilyen vegyületeket intenzíven tanulmányozták és széles körben használják.

A múltban a rekombináns fehérje előállításának fő módja a természetes forrásból való izolálása volt, amely általában nem hatékony és időigényes. A molekuláris biológiai technológiák legújabb fejlődése lehetővé tette egy adott anyagkészletet kódoló DNS klónozását olyan anyagok expressziós vektorába, mint a baktériumok, élesztő, rovarsejtek és emlőssejtek.

Egyszerűen fogalmazva, a rekombináns fehérjéket exogén DNS-termékek fordítják le élő sejtekben. Termelésük általában két fő szakaszból áll:

1. A molekula klónozása.
2. Fehérje expresszió.

Jelenleg egy ilyen szerkezet előállítása az orvostudomány és a biológia egyik leghatékonyabb módszere. A kompozíciót széles körben használják a kutatásban és a biotechnológiában.

Orvosi irány

A rekombináns fehérjék fontos szerepet játszanak kezelések különböző betegségek, például cukorbetegség, rák, fertőző betegségek, hemofília és vérszegénység esetén. Az ilyen anyagok közös készítményei közé tartoznak az antitestek, hormonok, interleukinok, enzimek és antikoagulánsok. Egyre nagyobb szükség van rekombináns készítményekre terápiás felhasználásra. Lehetővé teszik a kezelés módszereinek bővítését.

. A géntechnológiával nyert rekombináns fehérjék kulcsszerepet játszanak a terápiás gyógyszerek piacán. Jelenleg a legtöbb terápiás anyagot emlős sejtekben állítják elő, mivel összetételük képes a természeteshez hasonló, kiváló minőségű anyagok előállítására. Ezen túlmenően számos jóváhagyott rekombináns terápiás fehérje termelődik az E. coli-ban a jó genetika, a gyors növekedés és a rendkívül produktív termelés miatt. Pozitív hatással van az ezen anyagon alapuló gyógyszerek kifejlesztésére is.

Kutatás elvégzése

A rekombináns fehérjék előállítása különböző módszereken alapul. Az anyagok segítenek megismerni a test alapvető alapelveit. Ezek a molekulák felhasználhatók egy adott gén által kódolt anyag helyének azonosítására és meghatározására, valamint más gének funkcióinak feltárására különböző sejtaktivitásokban, mint például a sejtjelzés, az anyagcsere, a növekedés, a replikáció és a halál, a cikkben tárgyalt készítmények transzkripciója, transzlációja és módosítása.

Így a vizsgált összetételt gyakran használják a molekuláris biológiában, a sejtbiológiában, a biokémiában, a strukturális és biofizikai kutatásban és sok más tudományterületen. Ugyanakkor a rekombináns fehérjék előállítása nemzetközi gyakorlattal rendelkezik.

Az ilyen vegyületek hasznos eszközök az intercelluláris kölcsönhatások megértésében. Számos laboratóriumi módszerrel bizonyították hatékonyságukat, mint például az ELISA és az immunhisztokémia (IHC). A rekombináns fehérjék felhasználhatók enzimvizsgálatok kifejlesztésére. Ha egy pár megfelelő antitesttel kombinálva alkalmazzák, a sejtek felhasználhatók az új technológiák alkalmazásának szabványaként.

Biotechnológia

Az aminosav-szekvenciát tartalmazó rekombináns fehérjéket az iparban, az élelmiszertermelésben, a mezőgazdaságban és a biotechnológiában is használják. Például az állattenyésztésben az enzimek hozzáadhatók az élelmiszerekhez a takarmány-összetevők tápértékének növelése, a költségek és a hulladék csökkentése, a támogatás állati bél egészség, a termelékenység javítása és javítása a környezet.

Ezenkívül a tejsavbaktériumokat (LAB) már régóta használják erjesztett élelmiszerek előállítására, és a közelmúltban LAB-ot fejlesztettek ki olyan aminosav-szekvenciát tartalmazó rekombináns fehérjék expressziójára, amelyek széles körben alkalmazhatók például az emberi emésztés, az állatok és a táplálkozás javítására.

Az ilyen anyagoknak azonban vannak korlátai is:

1. Egyes esetekben a rekombináns fehérjék előállítása összetett, drága és időigényes.
2. A sejtekben előállított anyagok nem eshetnek egybe a természetes formákkal. Ez a különbség csökkentheti a terápiás rekombináns fehérjék hatékonyságát, sőt mellékhatásokat is okozhat. Ezenkívül ez a különbség befolyásolhatja a kísérletek eredményeit.
3. Az összes rekombináns gyógyszer fő problémája az immunogenitás. Minden biotechnológiai gyógyszer mutathat valamilyen immunogenitást. Nehéz megjósolni az új terápiás fehérjék biztonságát.

Általánosságban elmondható, hogy a biotechnológia fejlődése fokozta és megkönnyítette a rekombináns fehérjék előállítását különböző alkalmazásokhoz. Bár még mindig vannak hátrányai, az anyagok fontosak az orvostudományban, a kutatásban és a biotechnológiában.

Kapcsolat a betegségekkel

a rekombináns fehérje nem okoz kárt az embereknek. Ez csak egy közös molekula szerves része egy adott gyógyszer vagy élelmiszer elem kifejlesztésében. Számos orvosi vizsgálat kimutatta, hogy az elhízott egerek laboratóriumi törzsében az fgfbp3 fehérje (rövidítve BP3) kényszerített expressziója jelentősen csökkentette zsírtömegét, annak ellenére, hogy genetikai hajlamot mutatott a felhasználásra.

Az ilyen kísérletek eredményei azt mutatják, hogy az FGFBP3 fehérje új terápiát kínálhat a metabolikus szindrómával kapcsolatos rendellenességek, például a 2-es típusú cukorbetegség és a máj elhízás kiküszöbölésére. De mivel a BP3 természetes fehérje, nem pedig mesterséges gyógyszer, a rekombináns humán BP3 klinikai vizsgálata A preklinikai vizsgálatok utolsó fordulója után kezdődhet. On, vagyis az ilyen vizsgálatok elvégzésének biztonságával kapcsolatos okok. Rekombináns fehérje a lépésenkénti feldolgozás és tisztítás miatt nem okoz kárt az embereknek. A változások molekuláris szinten is előfordulnak.

A PD-L2-t, az immunterápia egyik kulcsszereplőjét jelölték a 2018-as fiziológiai vagy orvostudományi Nobel-díjra. Ezt a munkát James P professzor kezdte. Allison az USA-ból és Tasuku Honjo professzor Japánból, a checkpoint immunterápián alapuló rákok, például melanoma, tüdőrák és mások kezeléséhez vezetett. A közelmúltban az AMSBIO fontos új terméket adott hozzá immunterápiás vonalához - a PD-L2/TCR-CHO aktivátor rekombináns sejtvonal.

A koncepció tesztelésére irányuló kísérletekben a Birminghami Alabama Egyetem kutatói MD X vezetésével.Hosszú Zheng, Robert B Professzor. Adams és az UAB Orvostudományi Kar patológiai Tanszékének laboratóriumi Orvostudományi Tanszékének igazgatója kiemelte a ritka, de halálos véralvadási rendellenesség, a TTP lehetséges terápiáját.

. A tanulmány eredményei először bizonyítják, hogy a radamts13-mal terhelt vérlemezkék transzfúziója új és potenciálisan hatékony terápiás megközelítés lehet a veleszületett és immunmediált TTP-vel összefüggő artériás trombózishoz.

A rekombináns fehérje nemcsak tápanyag, hanem gyógyszer is a kifejlesztett gyógyszer összetételében. Ez csak néhány az orvostudományban jelenleg részt vevő területek közül, amelyek az összes szerkezeti elem tanulmányozásához kapcsolódnak. Amint azt a nemzetközi gyakorlat mutatja, az anyag szerkezete lehetővé teszi az emberi test számos súlyos problémájának kezelését molekuláris szinten.

Vakcina fejlesztés

A rekombináns fehérje egy specifikus molekulakészlet, amely modellezhető. Hasonló tulajdonságot használnak a vakcinák kifejlesztésében is. Egy új vakcinázási stratégia, más néven egy speciális rekombináns vírusinjekció alkalmazása, védelmet nyújthat a súlyos légzőszervi megbetegedések kockázatának kitett csirkék millióinak-jelentették az Edinburgh-i Egyetem és a Pirbright Intézet kutatói. Ezek a vakcinák a vírus ártalmatlan vagy gyenge verzióit használják, vagy baktériumok fecskendezze be a mikrobákat a test sejtjeibe. Ebben az esetben a szakértők rekombináns vírusokat használtak különböző tüskefehérjékkel vakcinákként, hogy ártalmatlan vírus két változatát hozzák létre. Sok különböző gyógyszerek erre a kapcsolatra épül.

A rekombináns fehérje a következő kereskedelmi nevekkel és analógokkal rendelkezik:

1. "Fortelizin".
2. "Zaltrap".
3. "Eilea".

Ezek elsősorban daganatellenes gyógyszerek, de vannak más kezelési területek is, amelyek ehhez a hatóanyaghoz kapcsolódnak.

A Nature Communications tudományos folyóiratban megjelent új tanulmány szerint egy új vakcina, más néven LASSARAB, amelynek célja az emberek védelme mind a Lassa-láz, mind a veszettség ellen, ígéretes eredményeket mutatott a preklinikai vizsgálatokban. Az inaktivált rekombináns vakcina jelöltje gyengített veszettség vírust használ.

A kutatócsoport a Lassa vírus genetikai anyagát illesztette be a veszettség vírusvektorába úgy, hogy a vakcina felszíni fehérjéket expresszált mind a Lassa, mind a veszettség sejtjeiben. Ezek a felszíni vegyületek immunválaszt okoznak a fertőző ágensek ellen. Ezután egy ilyen vakcinát inaktiváltak, hogy "elpusztítsák" az élő veszettség vírust ahhoz, hogy a fuvarozó.

A megszerzés módszerei

Az anyag előállításának számos rendszere létezik. A rekombináns fehérje előállításának általános módszere a biológiai anyag szintézisből történő előállításán alapul. De vannak más módok is.

Jelenleg öt fő kifejezési rendszer létezik:

1. Expressziós rendszer E. Coli.
2. Élesztő expressziós rendszer.
3. Rovarsejt-expressziós rendszer.
4. Emlős sejtexpressziós rendszer.
5. Sejtmentes fehérje expressziós rendszer.

Ez utóbbi lehetőség különösen alkalmas transzmembrán fehérjék és toxikus vegyületek expressziójára. Az utóbbi években a hagyományos intracelluláris módszerekkel nehezen expresszálható anyagokat sikeresen integrálták a sejtekbe in vitro. Fehéroroszországban a rekombináns fehérjék előállítását széles körben alkalmazták. Számos állami tulajdonú vállalkozás foglalkozik ezzel a kérdéssel.

A sejtmentes fehérjeszintézis rendszer gyors és hatékony módszer a célanyagok szintetizálására különféle szubsztrátok és energiakompozíciók hozzáadásával, amelyek szükségesek a transzkripcióhoz és a transzlációhoz a sejtkivonatok enzimrendszerében. Az utóbbi években az ilyen típusú anyagok sejtmentes módszereinek előnyei, mivel komplex fokozatosan alakult ki, mérgező membrán, amely bemutatja azok lehetséges alkalmazását a biofarmakon területén.

A sejtmentes technológia könnyen és szabályozhatóan számos nem természetes aminosavat adhat hozzá, hogy komplex módosítási folyamatokat érjen el, amelyeket a hagyományos rekombináns expresszió után nehéz megoldani. Az ilyen módszerek nagy alkalmazási értékkel és potenciállal rendelkeznek a vírusszerű részecskék felhasználásával történő gyógyszerszállítás és vakcinafejlesztés terén. Számos membránfehérjét sikeresen expresszáltak szabad sejtekben.

A vegyületek expressziója

A rekombináns CFP10-ESAT 6 fehérjét vakcinák előállítására használják. Az ilyen tuberkulózis allergén lehetővé teszi az immunrendszer erősítését és antitestek kifejlesztését. Általában, a molekuláris kutatás magában foglalja a fehérje bármely aspektusának tanulmányozását, mint például szerkezet, funkció, módosítások, lokalizáció, vagy kölcsönhatások. Annak vizsgálatához, hogy az egyes anyagok hogyan szabályozzák a belső folyamatokat, a kutatóknak általában szükségük van az érdeklődésre számot tartó funkcionális vegyületek előállítására.

Tekintettel a fehérjék méretére és összetettségére, a kémiai szintézis nem életképes lehetőség erre a törekvésre. Ehelyett az élő sejteket és azok sejtmechanizmusait általában gyárakként használják anyagok létrehozására és építésére a megadott genetikai sablonok alapján. A rekombináns fehérjék expressziós rendszere tovább fejleszti a gyógyszer létrehozásához szükséges szerkezetet. Ezután a szükséges anyag van kiválasztva a kábítószerek különböző kategóriái.

A fehérjékkel ellentétben a DNS könnyen előállítható szintetikusan vagy in vitro, jól bevált rekombináns módszerekkel. Következésképpen specifikus gének DNS-mátrixai, hozzáadott riporterszekvenciákkal vagy affinitáscímkeszekvenciákkal vagy anélkül, mátrixként felépíthetők a vizsgált anyag expressziójához. Az ilyen DNS-mátrixokból nyert ilyen készítményeket rekombináns fehérjéknek nevezzük.

Az anyag expressziójának hagyományos stratégiái közé tartozik a sejtek transzfekciója egy mátrixot tartalmazó DNS-vektor segítségével, majd a sejtek későbbi tenyésztése, hogy átírják és lefordítsák a kívánt fehérjét. Jellemzően a sejteket ezután lizáljuk, hogy kivonjuk az expresszált készítményt a későbbi tisztításhoz. A rekombináns CFP10-ESAT6 fehérjét ilyen módon dolgozzuk fel, és átadjuk a tisztító rendszert a toxinok lehetséges képződéséből. Csak ezután lép be a vakcinába szintézis céljából.

Mind a prokarióta, mind az eukarióta in vivo molekuláris anyagok expressziós rendszereit széles körben használják. A rendszer kiválasztása a fehérje típusától, a funkcionális aktivitás követelményeitől és a kívánt hozamtól függ. Ezek az expressziós rendszerek közé tartoznak az emlősök, rovarok, élesztő, baktériumok, algákés sejtek. Minden rendszernek megvannak a maga előnyei és problémái, és az adott alkalmazáshoz megfelelő rendszer kiválasztása fontos a cikkben áttekintett anyag sikeres kifejezéséhez.

Emlősök kifejezése

A rekombináns fehérjék alkalmazása lehetővé teszi különböző szintű vakcinák és gyógyszerek kifejlesztését. Ehhez az anyag előállításának ez a módja használható. Az emlősök expressziós rendszerei felhasználhatók olyan fehérjék előállítására az állatvilágból, amelyek fiziológiailag releváns környezetük miatt a leginkább natív szerkezettel és aktivitással rendelkeznek. Ez magas szintű poszttranszlációs feldolgozáshoz és funkcionális aktivitáshoz vezet. Az emlős expressziós rendszerek felhasználhatók antitestek, komplex fehérjék és vegyületek előállítására sejtalapú funkcionális vizsgálatokban való felhasználásra. Ezeket az előnyöket azonban keményebb kulturális feltételekkel kombinálják.

Az emlős expressziós rendszerek felhasználhatók fehérjék előállítására ideiglenesen vagy stabil sejtvonalakon keresztül, ahol az expressziós konstrukció integrálódik a gazdaszervezet genomjába. Míg az ilyen rendszerek több kísérletben is felhasználhatók, az ideiglenes termelés nagy mennyiségű anyagot generálhat egy-két hét alatt. Az ilyen típusú rekombináns fehérjék biotechnológiája nagy szükség van.

Ezek a tranziens, rendkívül produktív emlős expressziós rendszerek szuszpenziós tenyészeteket használnak, amelyek gramm / liter eredményt adhatnak. Ezen túlmenően ezeknek a fehérjéknek több natív hajtogatási és poszttranszlációs módosítása van, mint például a glikozilezés egyéb expressziós rendszerek.

Kifejezés egy rovarból

A rekombináns fehérjetermelési módszerek nem korlátozódnak csak emlősökre. A termelési költségek szempontjából termelékenyebb módszerek is vannak, bár az anyag hozama a kezelt folyadék 1 literére sokkal alacsonyabb.

A rovarsejtek felhasználhatók magas szintű fehérje expresszióra, az emlős rendszerekhez hasonló módosításokkal. Számos rendszer használható rekombináns baculovírus előállítására, amelyet ezután felhasználhatunk a rovarsejtekben érdekes anyag kivonására.

A rekombináns fehérjék expressziója könnyen bővíthető és nagy sűrűségű szuszpenziós tenyészethez igazítható összetett molekulák nagy léptékű előállításához. Funkcionálisan hasonlítanak az emlősök natív összetételéhez. Bár a hozam akár 500 mg/l is lehet, a rekombináns baculovírus termelése hosszú időt vehet igénybe, és a termesztési feltételek összetettebbek, mint a prokarióta rendszerek. A déli és melegebb országokban azonban ez a módszer hatékonyabbnak tekinthető.

Bakteriális expresszió

A rekombináns fehérjék termelése baktériumok segítségével is megállapítható. Ez a technológia sokkal különbözik a fent leírtaktól. A bakteriális fehérje expressziós rendszerek népszerűek, mivel a baktériumok könnyen tenyészthetők, gyorsan növekednek és magas hozamot adnak a rekombináns összetételnek. A baktériumokban expresszált többdoménű eukarióta anyagok azonban gyakran nem funkcionálisak, mert a sejtek nincsenek felszerelve a szükséges transzláció utáni módosítások vagy molekuláris hajtogatás elvégzésére.

Ezenkívül sok fehérje oldhatatlanná válik inklúziós molekulák formájában, ezek nagyon nehéz visszanyerni merev denaturátorok és az ezt követő nehézkes molekuláris összetételű újraillesztési eljárások nélkül. Javarészt, ezt a módszert továbbra is nagyrészt kísérleti jellegűnek tekintik.

Sejtmentes expresszió

A sztafilokináz aminosav-szekvenciáját tartalmazó rekombináns fehérjét kissé eltérő módon kapjuk meg. Számos típusú injekció része, amely használat előtt több rendszert igényel.

A sejtmentes fehérje expresszió egy anyag szintézise in vitro teljes sejtek transzlációs kompatibilis kivonatainak felhasználásával. Elvileg a teljes sejtkivonatok tartalmazzák az összes makromolekulát és komponenst, szükséges transzkripció, fordítás, sőt poszttranszlációs módosítás.

Ezek a komponensek közé tartoznak az RNS polimeráz, a szabályozó fehérje faktorok, a transzkripciós formák, a riboszómák és a tRNS-ek. Kofaktorok, nukleotidok és egy specifikus génmátrix hozzáadásával ezek a kivonatok néhány órán belül képesek szintetizálni az érdekes fehérjéket.

Bár nem fenntarthatóak a nagyüzemi termelés szempontjából, a sejtmentes vagy in vitro fehérje expressziós (IVT) rendszereknek számos előnye van a hagyományos in vivo rendszerekkel szemben.

A sejtmentes expresszió lehetővé teszi a rekombináns vegyületek gyors szintézisét sejttenyészet bevonása nélkül. A sejtmentes rendszerek lehetővé teszik a fehérjék módosított aminosavakkal történő címkézését, valamint olyan vegyületek expresszálását, amelyek az intracelluláris proteázok gyors proteolitikus lebomlásán mennek keresztül. Ezenkívül a sejtmentes módszer alkalmazásával könnyebb sok különböző fehérjét egyszerre expresszálni (például a fehérje mutációk tesztelésére sok különböző rekombináns DNS-mátrixból kis mértékben expresszálva). Ebben a reprezentatív kísérletben IVT rendszert használtunk a kaszpáz-3 fehérje expresszálására emberekben.

Következtetések és kilátások a jövőre nézve

A rekombináns fehérjetermelés most érett tudományágnak tekinthető. Ez a tisztítás és az elemzés számos növekményes javításának eredménye. Jelenleg a kábítószer-felfedező programok ritkán állnak le a célfehérje előállításának képtelensége miatt. Számos rekombináns anyag expressziójának, tisztításának és elemzésének párhuzamos eljárásai ma már jól ismertek a világ számos laboratóriumában.

A fehérjekomplexek és a szolubilizált membránszerkezetek létrehozásának növekvő sikere további változtatásokat igényel, hogy lépést tartsanak a kereslettel. A hatékony szerződéses kutatási szervezetek megjelenése a fehérjék rendszeresebb ellátására lehetővé teszi a tudomány erőforrásainak újraelosztását ezen új problémák megoldására.

Ezenkívül a párhuzamos munkafolyamatoknak lehetővé kell tenniük a vizsgált anyag teljes könyvtárainak létrehozását, amelyek lehetővé teszik az új célok azonosítását és a továbbfejlesztett szűrést, valamint a hagyományos kis molekulájú gyógyszerdetektálási projekteket.