Áramlási citofluorimetria-a lényeg és alkalmazás

Az áramlási citofluorimetria citológiai kutatási módszer, a sejtek mélyreható elemzésére szolgál. Előnye, hogy lehetővé teszi az egyes cellák külön tanulmányozását. Ez a fajta elemzés segít több paraméter értékelésében több száz cellában másodpercek alatt. Ennek köszönhetően a citofluorimetriát az egyik leggyorsabb és legpontosabb elemzési módszernek tekintik, amely jelenleg a tudósok és a klinikusok rendelkezésére áll.

Alapelv

Az áramlási citofluorimetriás módszer elve a sejtek fényszóródásának és lumineszcenciájának (fluoreszcenciájának) mérésén alapul. A sejtszuszpenziót nagy sebességgel áram formájában vezetik át a citométer sejtjén, ahol lézerrel besugározzák. Az úgynevezett hidrodinamikai fókuszálást ott is elvégzik. Mechanizmusa abban áll, hogy a sejtből a vizsgált részecskékkel a kimeneten történő áramlás egy külső sugárba áramlik, amelynek nagyobb a sebessége. Ennek eredményeként a részecskék rendezett láncban vannak elrendezve.

A sejteket speciális fluoreszcens színezékekkel (fluorokrómokkal)előjelezzük. Nekik köszönhetően a lézersugár másodlagos fényt gerjeszt. A vett fényjeleket detektorok rögzítik. Ezt követően az információkat olyan szoftver algoritmusok segítségével dolgozzák fel, amelyek lehetővé teszik az egyes sejtpopulációk számlálását, amelyek bármilyen kritérium szerint különböznek egymástól.

A hagyományos mikroszkópos vizsgálat gyakran nem teszi lehetővé a különböző sejtek megkülönböztetését, mivel ugyanúgy néznek ki. A citofluorimetria más adatokat szolgáltathat (a DNS-szerkezet integritása), elemezheti a fehérje expresszióját, a sejtek túlélését.

Mivel a fluorokrómok gerjesztéséhez különböző hullámhosszú fénysugarakra, valamint különböző típusú detektorokra van szükség, a modern berendezések több detektáló csatornával vannak felszerelve (4-től 30-ig). A lézerkibocsátók száma 1-7 lehet. A bonyolultabb eszközök lehetővé teszik a részecskék több tulajdonságának többparaméteres vizsgálatát egyszerre.

Előnyök és hátrányok

Az áramlási citofluorimetria előnyei a következők:

• , nagy feldolgozási sebesség (akár 30 ezer esemény regisztrálása 1 másodperc alatt);
• lehetőség nagyszámú sejt tanulmányozására (akár 100 millió. mintában);
• a fluoreszcens sugárzás intenzitásának mennyiségi értékelése;
• az egyes sejtek elemzése;
• heterogén folyamatok egyidejű vizsgálata;
• automatikus adatszétválasztás sejtpopulációk szerint;
• az eredmények kiváló minőségű megjelenítése.

Ennek a technológiának egy másik jellemzője, hogy az elemzett részecske több fluoreszcens oldattal festhető. Ennek köszönhetően többparaméteres vizsgálat történik.

A hátrányok közé tartozik a műszaki berendezések összetettsége és a speciális minta előkészítésének szükségessége.

Citométerek

Az első ilyen típusú eszközök már 1968-ban megjelentek Németországban, de sokkal később elterjedtek. Jelenleg az áramlási citofluorometria módszerével működő összes eszköz 2 típusra osztható:

• fluoreszcens sugárzást mérő eszközök (két vagy több hullámhossz), fényszórás 10 és 90 MHz szögben (kis szögű és oldalsó szórásérzékelő);
• olyan eszközök, amelyek több cellás paraméter mérése mellett automatikusan csoportokba rendeződnek ezen kritériumok szerint.

A közvetlen fényszórás detektort úgy tervezték, hogy meghatározza a sejt méretét, és az oldalsó fényszórás regisztrálására szolgáló eszköz lehetővé teszi, hogy információt szerezzen az intracelluláris granulátumok jelenlétéről, a citoplazma térfogatarányáról és a magról.

A klasszikus citométerek, ellentétben a fénymikroszkópokkal, nem teszik lehetővé a sejt képét. Az utóbbi években azonban olyan kombinált eszközöket fejlesztettek ki, amelyek képesek kombinálni a mikroszkóp és a citofluoriméter képességeit. Az alábbiakban beszélünk róluk.

Citométerek megjelenítése

Az egyik jellemző a klasszikus áramlási citofluorometriában használt eszközökre jellemző: ha ritka eseményeket regisztrálnak az elemzett sejtek populációjában, akkor nincs mód annak értékelésére, hogy mi a lényegük. Ezek a részecskék kiderülhetnek, hogy az elhalt sejtek maradványai, vagy ezek ritka csoportja. A hagyományos eszközökben az ilyen adatok kizárásra kerülnek az események általános áramlásából, azonban különösen fontosak lehetnek a tudományos és klinikai elemzés szempontjából.

Az új generáció áramlási citométereinek vizualizálása lehetővé teszi, hogy rögzítse az egyes cellák képét, amelyek az áramlásban áthaladnak az érzékelő zónán. Könnyen látható, ha rákattint a diagram megfelelő területére, amely megjelenik a számítógép monitorán.

Alkalmazási területek

Áramlási citofluorimetria – univerzális módszer, amelyet az orvostudomány és a tudomány számos területén használnak:

• immunológia;
• onkológia;
• transzplantológia (vörös csontvelő, őssejtek átültetése);
• hematológiai;
• toxikológia;
• biokémia (a sejten belüli savasság mérése, egyéb paraméterek vizsgálata);
• farmakológia (új gyógyszerek létrehozása);
• mikrobiológia;
• parazitológia és virológia;
• oceanológia (fitoplankton vizsgálata a tározók állapotának és egyéb feladatok felmérésére);
• nanotechnológia és mikrorészecskék elemzése.

Immunológia

Az emberi immunrendszer számos különböző sejtből áll. Az áramlási citofluorimetria az immunológiában lehetővé teszi szerkezetük és funkcióik értékelését, Vagyis morfofunkcionális elemzés elvégzését.

Az ilyen vizsgálatok segítenek az immunitás komplex jellegének tanulmányozásában. A sejtek fenotípusai az antigének aktiválása, a patológiák kialakulása és egyéb tényezők következtében változnak. A citofluorimetria képes elkülöníteni az immunsejtek alcsoportjait egy komplex keverékben, és értékelni az összes dinamikai változást.

Onkológia

Az onkológia egyik legfontosabb feladata a sejtek típus szerinti differenciálódása. Az onkohematológiában az áramlási citofluorimetria módszerével végzett elemzés elve a következő jelenségen alapul: amikor egy mintát speciális fluoreszcens festékkel dolgoznak fel, a citoplazmatikus fehérjékhez kötődik. Az aktívan proliferáló sejtekben történő felosztás után tartalma felére csökken. Ennek megfelelően a sejtek fényének intenzitása kétszeresére csökken.

A proliferáló sejtek kimutatásának más módjai is vannak:

• DNS-kötő festékek (propidium-jodid)használata;
• jelölt uracil alkalmazása;
• a sejtciklus szabályozásában részt vevő ciklinfehérjék fokozott expressziójának regisztrálása.