Affinitás kromatográfia az orvostudományban: jellemzők és alkalmazás

A kromatográfia az anyagok elválasztásának egyik módja. Ezt a mikrorészecskék fizikai és kémiai tulajdonságainak későbbi minőségi és mennyiségi elemzésére használják. Ennek a technológiának a változata az affinkromatográfia. A fehérjevegyületek megkülönböztetésének gondolata a molekulák affinitási tulajdonságával már évtizedek óta ismert a tudományban. Fejlesztése azonban csak az utóbbi években történt, a mátrixként használt rendkívül porózus hidrofil anyagok bevezetése után. Ez a módszer lehetővé teszi mind az analitikai feladatok (az anyagok szétválasztása és azonosítása), mind a preparatív (Tisztítás, koncentráció)megoldását.

A lényeg

Az affinkromatográfia (a latin affinis szóból – "szomszédos"," rokon") Affin kölcsönhatásokon alapul, amelyek a szeparátor molekula (ligandum vagy affináns) és a célmolekula közötti nagyon specifikus kötések kialakulását jelentik. Ezek a mechanizmusok széles körben elterjedtek a természetben (mediátorok vagy hormonok és receptorok, antitestek és antigének kommunikációja, polinukleotidok hibridizációja és más típusú folyamatok). Az affinitáskromatográfiát 1951 óta használják az orvostudományban gyakorlati célokra.

Az alkatrészek elválasztása a következőképpen történik:

• az izolálandó anyagot tartalmazó munkaoldatot a szorbensen vezetjük át;
• a szorbens mátrixra felvitt ligandum ezt az anyagot tartja;
• koncentrációja (felhalmozódása) fordul elő;
• az izolált anyag extrakciója a szorbensből oldószerrel történő mosással.

Ez a módszer lehetővé teszi az egész sejtek izolálását. A hagyományos szorpciós kromatográfiától való különbség az, hogy az izolált komponens erős biospecifikus kötődése van a szorbenshez, amelyet nagy szelektivitás jellemez.

Adszorbensek

Adszorbensként a következő anyagokat használják:

• Az agarózon alapuló gélszerű készítmények, az agarból nyert poliszacharid. 3 fajtát használnak leggyakrabban: sepharose 4 B, CL (térhálósított agaróz) és affi-gél. Ez utóbbi készítmény agaróz és poliakrilamid módosított gélje. Nagyobb biológiai tehetetlenséggel, magas kémiai és termikus ellenállással rendelkezik.
• Szilícium-dioxid (szilikagél).
• Üveg.
• Szerves polimerek.

A ligandum érintkezés során fellépő mechanikai akadályok kiküszöbölése érdekében további anyagokat használnak a hordozótól való elválasztáshoz (peptidek ,diamin, poliaminok, oligoszacharidok).

Felszerelés

Az affinitáskromatográfiás berendezés a következő fő komponenseket tartalmazza:

• tárolótartályok mozgó fázishoz (eluens);
• Nagynyomású szivattyúk a közepes kínálat (leggyakrabban viszonzó);
• szűrő az eluensek porból történő tisztításához;
• adagoló eszköz;
• kromatográfiás oszlop a keverék elválasztásához;
• detektor az oszlopból kilépő elválasztott alkatrészek detektálására;
• kromatogram-felvevők és mikroprocesszor-egységek (számítógép).

Az oldott levegő mennyiségének csökkentése érdekében a héliumot előzetesen átvezetik a mobil fázison. Az eluens koncentrációjának megváltoztatásához több programozó által vezérelt szivattyút telepítenek. A kromatográfiás oszlopok rozsdamentes acélból (fokozott korrózióállósági követelményekkel), üvegből (univerzális változat) vagy akrilból készülnek. Előkészítő célokra átmérőjük 2-70 cm lehet. Az analitikai kromatográfiában a Mikrooszlopokat (10-150 mikron) használják.

Az érzékelők érzékenységének növelése érdekében reagenseket vezetnek be a keverékbe, amelyek hozzájárulnak olyan anyagok képződéséhez, amelyek több sugarat szívnak fel a spektrum ultraibolya vagy látható régiójában.

A vezetés módszertana

A folyadék affinitás kromatográfiának 2 fő típusa van:

• Oszlop, amelyben az oszlopot állófázissal töltik meg, és eluens áramlású keveréket vezetnek át rajta. Az elválasztás nyomás alatt vagy a gravitáció következtében történhet.
• Vékony réteg. Az eluens egy lapos adszorbens réteg mentén mozog kapilláris erők hatására. Az adszorbens üveg, kerámia vagy kvarcpálca, fémfólia lemezre kerül.

A fő a munka szakaszai tartalmazza:

• adszorbens készítmény, ligandum rögzítés a hordozón;
• a keverék betáplálása a kromatográfiás oszlopba történő elválasztáshoz;
• a mobil fázis betöltése, a komponens ligandummal való kötése;
• , fáziscsere a kötött anyag felszabadulásához.

Kinevezés

Az affinitáskromatográfiát a következő típusú anyagok izolálására használják (az ebben az esetben használt ligandum típusát zárójelben jelezzük):

• enzimatikus inhibitorok, szubsztrátok és kofaktorok (enzimek)analógjai;
• genetikai idegenség jeleit mutató bioorganikus anyagok, vírusok és sejtek (antitestek);
• nagy molekulatömegű szénhidrátok, monoszacharid polimerek, glikoproteinek (lektinek);
• nukleáris fehérjék, nukleotidil-transzferázok (nukleinsavak);
• receptorok, transzportfehérjék (vitaminok, hormonok);
• a sejtmembránokkal (sejtekkel)kölcsönhatásba lépő fehérjék.

Ezt a technológiát immobilizált enzimek előállítására is használják, amelyek cellulózhoz való kötése lehetővé teszi immunszorbensek előállítását.

DNS-kötő fehérjék kromatográfiája

A DNS-kötő fehérjéket heparin alkalmazásával izoláljuk. Ez a glikozaminoglikán számos molekulát képes megkötni. Az ebbe a csoportba tartozó fehérjék affinitás-kromatográfiáját olyan anyagok izolálására használják, mint például:

• transzlációs iniciációs és megnyúlási faktorok (nukleinsav-és fehérjemolekulák szintézise);
• restriktázok (enzimek, amelyek felismerik a kettős szálú DNS specifikus szekvenciáit);
• DNS-ligázok és polimerázok (enzimek, amelyek két molekula kapcsolatát katalizálják, hogy új kémiai kötést képezzenek, és részt vesznek a DNS-replikációban);
• szerin proteáz inhibitorok, amelyek fontos szerepet játszanak az immun-és gyulladásos folyamatokban;
• növekedési faktorok: fibroblasztok, Schwann, endothel;
• az intercelluláris mátrix fehérjéi;
• hormon receptorok;
• lipoproteinek.

Méltóságok

Ez a módszer az egyik legspecifikusabb a reaktív vegyületek (enzimek és nagyobb aggregátumok – vírusok)izolálására. Azonban nem csak a biológiailag aktív anyagok izolálására használják.

Az antitestek kis mennyiségben történő kimutatása, a poliadenilsav mennyiségi értékelése, a dehidrogenázok molekulatömegének kifejezett meghatározása, bizonyos szennyező anyagok eltávolítása, a tripszin inaktív formájának aktivációs kinetikájának vizsgálata, az emberi interferonok molekuláris szerkezete - ez nem a vizsgálatok teljes listája, amelyben az affinitás kromatográfiát használják. A klinikán történő alkalmazás előnyei a következők:

• A fehérjék, poliszacharidok, nukleinsavak hatékony tisztításának lehetősége. Fizikai-kémiai tulajdonságaikban kissé különböznek egymástól, és elveszítik aktivitásukat a hidrolízis, a denaturálás és az egyéb módszerekben alkalmazott más típusú expozíció során.
• Az anyagok szétválasztásának sebessége, a folyamat dinamikus jellege.
• Nincs szükség az enzimek speciális tisztítására és az izoenzimek homogenizálására a disszociációs állandók meghatározásához.
• Az anyagok széles körének szétválasztásának lehetősége.
• A ligandumok alacsony fogyasztása.
• Az anyagok nagy mennyiségben történő elválasztásának lehetősége.
• Biológiai makromolekulák reverzibilis kötési folyamata.

Ez a technika kombinálható másokkal, hogy további mezőt (gravitációs, elektromágneses)szabjon ki. Ez lehetővé teszi a kromatográfia technikai képességeinek bővítését.

Enzyme engineering

Ennek a módszernek köszönhetően megkezdődött a biotechnológia új ágának – az enzimtechnika-aktív fejlesztése.

Az enzimek izolálásával kapcsolatos affinitás-kromatográfia a következő előnyökkel jár:

• az enzimek nagy mennyiségben történő megszerzése a kevesebb eltöltött idő eredményeként – az árcsökkenés következtében;
• az enzimek immobilizálása lehetővé teszi, hogy jelentősen bővítsék alkalmazási körüket az orvostudományban és az iparban;
• az enzimek oldhatatlan szilárd szubsztráttal való összekapcsolása lehetővé teszi a mikrokörnyezet hatásának és a természetes és fiziológiai folyamatokban fontos szerepet játszó reakciók irányának tanulmányozását.