Rekombináns dns: leírás, jellemzők

A rekombináns DNS egy olyan molekula, amelyet laboratóriumi módszerekkel állítanak elő genetikai rekombináció több forrásból származó genetikai anyag kombinálására. Ez azért lehetséges, mert az összes organizmus DNS-molekulái azonos kémiai szerkezettel rendelkeznek, és csak a benne lévő nukleotidszekvenciában különböznek egymástól.

Teremtés

A molekuláris klónozás egy rekombináns DNS előállítására használt laboratóriumi eljárás. Ez a két legszélesebb körben alkalmazott módszer egyike, a polimeráz láncreakcióval (PCR)együtt. Ez lehetővé teszi a kísérletező által kiválasztott bármely specifikus DNS-szekvencia replikációjának szabályozását.

Két alapvető különbség van a rekombináns DNS technikák között. Az egyik az, hogy a molekuláris klónozás magában foglalja a replikációt egy élő sejtben, a PCR-t pedig egy kémcsőben. Egy másik különbség az, hogy az első módszer lehetővé teszi a DNS-szekvenciák vágását és beillesztését, míg a második a meglévő szekvencia másolásával javul.

DNS vektor

A rekombináns DNS előállításához klónozó vektor szükséges. Plazmidokból vagy vírusokból származik, viszonylag kis szegmens. A molekuláris klónozáshoz szükséges vektor kiválasztása a gazdaszervezet választásától, a klónozott DNS méretétől, valamint attól függ, hogy idegen molekulákat kell-e kifejezni. A szegmensek különféle módszerekkel kombinálhatók, például restrikciós / ligáz klónozással vagy Gibson összeszereléssel.

Klónozás

A szokásos protokollokban a klónozás hét lépést foglal magában.

1. A gazdaszervezet kiválasztása és a klónozó vektor.
2. DNS-vektor megszerzése.
3. Klónozott DNS kialakulása.
4. Rekombináns DNS létrehozása.
5. Bevezetése a gazda testébe.
6. Az azt tartalmazó organizmusok kiválasztása.
7. A kívánt DNS-betétekkel és biológiai tulajdonságokkal rendelkező klónok kiválasztása.

A gazdatestbe történő átültetés után a rekombináns szerkezetben lévő idegen molekulák expresszálódhatnak vagy nem. Az expresszióhoz génátalakításra van szükség a DNS-termeléshez szükséges szekvenciák beépítéséhez. Ezt a gazda transzlációs készüléke használja.

Hogyan működik

A rekombináns DNS akkor működik, ha a gazdasejt rekombináns génekből származó fehérjét expresszál. Az expresszió a gén környezetétől függ, olyan jelkészlettel, amely utasításokat ad a transzkripcióhoz. Ezek közé tartozik a promoter, riboszóma kötésés Terminátor.

Problémák merülnek fel, ha a gén intronokat vagy jeleket tartalmaz, amelyek terminátorként működnek a bakteriális gazdaszervezet számára. Ez idő előtti felmondáshoz vezet. Rekombináns fehérje lehet, hogy helytelenül feldolgozzák, hajtogatják vagy lebontják. Eukarióta rendszerekben történő termelése általában élesztő és fonalas gombákban fordul elő. Az állati ketrecek használata nehéz, mivel sok embernek erős támasztófelületre van szüksége.

A szervezetek tulajdonságai

A rekombináns DNS-molekulákat tartalmazó organizmusok egyértelműen normális fenotípusúak. Megjelenésük, viselkedésük és anyagcseréjük általában nem változik. A rekombináns szekvenciák jelenlétének kimutatásának egyetlen módja maga a DNS vizsgálata polimeráz láncreakciós teszt segítségével.

Egyes esetekben a rekombináns DNS káros hatással lehet. Ez akkor fordulhat elő, ha az aktív promótert tartalmazó fragmens a gazdasejt korábban csendes génje mellett helyezkedik el.

Használata

A rekombináns DNS technológiát széles körben használják a biotechnológiában, az orvostudományban és a kutatásban. Fehérjéi és egyéb termékei szinte minden nyugati gyógyszertárban, állatorvosi rendelőben, orvosi rendelőben, orvosi vagy biológiai laboratóriumban megtalálhatók.

A leggyakoribb alkalmazás az alapkutatás, amelyben a technológia fontos a biológiai és orvosbiológiai tudományok legmodernebb munkájához. A rekombináns DNS-t a gének azonosítására, leképezésére és szekvenciájára, valamint funkciójuk meghatározására használják. az rDNS-próbákat az egyes sejtekben és az egész organizmusok szöveteiben lévő génexpresszió elemzésére használják. A rekombináns fehérjéket reagensként használják laboratóriumi kísérletekben. Néhány konkrét példa az alábbiakban található.

Rekombináns kimozin

Az oltóban található kimozin egy enzim, szükséges a sajt előállítása. Ez volt az első géntechnológiával módosított élelmiszer-adalékanyag, amelyet az iparban használtak. Mikrobiológiailag előállított rekombináns enzim, szerkezetileg azonos a borjúból nyert enzimmel, olcsóbb és nagy mennyiségben állítják elő.

Rekombináns humán inzulin

Szinte teljesen helyettesítette az állati eredetű inzulint (például sertések és szarvasmarhák) az inzulinfüggő cukorbetegség kezelésére. A rekombináns inzulint úgy szintetizáljuk, hogy az emberi inzulin gént az Etherichia nemzetség baktériumaiba vagy élesztőbe vezetjük.

Növekedési Hormon

Olyan betegeknek írják fel, akiknél az agyalapi mirigy elégtelen mennyiséget termel növekedési hormon a normális fejlődés fenntartása. Mielőtt a rekombináns növekedési hormon elérhetővé vált, a holttestek agyalapi mirigyéből nyerték. Ez a nem biztonságos gyakorlat néhány betegnél Creutzfeld-Jakob-betegség kialakulásához vezetett.

Rekombináns véralvadási faktor

Ez egy véralvadási fehérje, amelyet véralvadási rendellenességekkel járó hemofília formájú betegeknek adnak be. Nem képesek elegendő mennyiségben előállítani a VIII-as faktort. A rekombináns VIII-as faktor kifejlesztése előtt a fehérjét több donor nagy mennyiségű emberi vérének feldolgozásával nyertük. Ez nagyon magas kockázatot jelentett a fertőző betegségek átvitelére.

A HIV-fertőzés diagnosztizálása

A HIV-fertőzés diagnosztizálására szolgáló három széles körben alkalmazott módszer mindegyikét rekombináns DNS alkalmazásával fejlesztették ki. Az antitest teszt a fehérjét használja. Reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval határozza meg a HIV genetikai anyag jelenlétét. A teszt kifejlesztését a molekuláris klónozás és a HIV genomok szekvenciájának elemzése tette lehetővé.